植物源农药研究进展

    在中国，由于化学农药的滥用导致40种以上的主要农作物的病原微生物和害虫产生抗药性、生态环境恶化、生物多样性水平降低等一系列问题，而且传统化学农药往往含有对人畜有害的成分，以植物体内对病原菌具有拮抗性的化学物质为主要成分的植物源农药，因其具有低毒、低残留、对非靶标生物及环境安全的特点而越来越受到重视。据研究，常用植物源农药有生物碱类化合物、黄酮类化合物、萜类化合物、挥发油等，不同类型的化合物具有不同的骨架结构，根据化合物特性的的不同，选择不同方式进行提取，不同的化合物也具有不同的抑菌及提高植物抗氧化力等生理特性。本文综述了植物源农药中常见活性成分的结构表征、提取方式及其抑菌研究进展，旨为植物源农药的开发提供技术支撑。
一、植物源农药常用的活性提取物

1.生物碱类化合物
 
    目前已发现的21,000多种生物碱类化合物，多分布在茄科植物的种、果、花、茎等植物部位。生物碱类化合物大多为环状结构，氮素被包含在碳环内。在抑菌时C1、C2、C9和C10中的羟基作为取代基会出现结构取代的情况。生物碱常见类型有异喹啉类生物碱、喹啉类生物碱、吲哚类生物碱、哌啶类生物碱等，其中N-甲基四氢原小檗碱、原小檗碱和苯胺类生物碱的C2和C3的4阶碳和亚甲二氧基在提高N-甲基四氢原小檗碱的抗病毒、抗菌和抗真菌活性方面起着重要作用。当进行生物碱类化合物的结构优化时，可重点优化生物碱的C2和C3的4阶碳和亚甲二氧基，从而提高该类型化合物的抑菌效果。
 
2.黄酮类化合物
 
    黄酮类化合物目前已发现800余种，属于植物的次生代谢物质。黄酮类的化学结构类型较多，一般以C6-C3-C6的形式为基础。黄酮类化合物是苯并-γ-pyrone衍生物，当病菌对其进行侵染时，它会根据其侧组位置和换位进行分类；其药理作用主要是根据它的结构类别、羟基化程度、其他取代和共轭以及聚合程度相互协同合作，其中类黄酮在生物系统中保护作用归因于它们传递氢或电子自由基的能力；而芳香环上特殊位置的羟基能够提高抑菌作用。在进行黄酮类化合物的结构优化时，可先寻找到该物质芳香环的羟基，调整其位置，再查看该羟基在新位置上与它的结构类别、其他取代和共轭以及聚合程度互相协作的效果，从而达到整体提高黄酮类化合物的抑菌效果。

3.萜类化合物
 
    在天然产物中，萜类化合物是结构 多、结构 大的化合物之一，目前已发现50,000多种。萜类化合物可根据异戊二烯进行分类，即将不同碳数量及组成结构进行线性排列，形成多个异戊二烯单元组成的头尾相连的异戊二烯聚合体，少部分萜类化合物也会以各种含氧衍生物的形式存在。萜类化合物主要由甲羟戊酸途径生成，但也可能来源于2-C-甲基-D-赤藓糖醇4-磷酸，而缺少吡喃环时，则一般被认为没有活性，不具备抑菌作用。在进行萜类化合物的结构优化时，可以吡喃环为切入点进行研究，来提高萜类化合物的抑菌效果。

4.挥发油
   
    挥发油又称植物精油，主要来自芳香植物，是脂溶性的天然化合物。植物精油成分复杂，按化学结构分为芳香族、脂肪族和萜类，其中以萜类成分为主，主要包括单帖、倍半萜以及醇类、酚类、醚类、醛、酮、羧酸和酯等含氧衍生物。挥发油的活性可能是由某些小化合物如香芹酮的存在所致。挥发油所含成分太多，可推测出抑菌作用主要源于它的组成成分的协同作用，并非一种物质的作用。进行结构优化太过复杂。
 
二、活性物质提取方式
 
    植物会通过自身的代谢功能合成不同的化学物质以及衍生物，这些物质具有抑菌、抗病、抗氧化等作用。因此可以根据不同成分的特性选择合适提取方式进行成分提取。
 
1.生物碱类化合物
 
    在提取生物碱时，生物碱的溶解性能是提取方式选择依据，因此根据不同生物碱在不同溶剂中的溶解度进行溶剂选择，在进行亲水性生物碱的提取时要注意溶剂酸碱度的调节。Wei等将白屈菜粉碎后超声波提取，固液比为1∶8，提取液为75%乙醇，85%超声频率提取35 min得到白屈菜红碱；白屈菜红碱浓度为1.7×10^-6mg/mL时，抑菌活性 高，对番茄枯萎病菌Z0413、黄瓜枯萎病菌Z0418等具有使用量少、抑菌性强的特点。Han等将延胡索粉碎后用正乙烷、乙酸乙酯、氯仿浸提分馏，纯化后得到3种异喹啉生物碱脱氢木犀草碱、针刺碱和虫草碱，3种碱对小麦叶锈病菌、花椒炭疽病菌均有一定的抑制作用，研究发现C-13和季铵盐中甲基的缺失氮原子在抗真菌药物中起着重要作用。陈伟等依次使用乙酸、氨水、正丁醇和甲醇对马铃薯薯芽与薯皮进行粉碎萃取，不断调节溶剂酸碱度， 后得到马铃薯糖苷生物碱；随着浓度增大，马铃薯糖苷生物碱对枸杞致腐病原菌镰孢菌的抑制作用随之增强，但浓度不能高于0.15 g/mL。周兵等按照醇-酸水-有机溶剂提取（95%乙醇回流提取2 h后，依次用酸性水溶液和浓氨水进行酸碱处理， 后用氯仿萃取）法对碎米莎草茎进行总生物碱提取；随着浓度的增加，总生物碱对水稻稻瘟病菌、油菜菌核病菌、番茄早疫病菌和杨树溃疡病菌的抑制作用随之增加，但对水稻苗高有严重抑制作用。
因此，在提取生物碱时，不光要根据溶剂极性来提取对应的生物碱类化合物，还要在提取过程中不断调节溶剂的酸碱度。不同类型的生物碱对不同的植物病害有一定的抑制作用，总生物碱类化合物不能用于水稻田，会影响水稻幼苗的生长。

2.黄酮类化合物
 
    黄酮类化合物提取的关键在于所提取的黄酮类物质是游离苷元还是苷类化合物，不同的化合物使用极性不同的溶剂，极性越大的溶剂所提取的极性化合物含量会越多，不同极性的溶剂混合提取会出现协同作用。Bartmańska等使用不同极性的溶剂分别从废除的啤酒花残渣中浸提得到7种黄酮类化合物，其中2种为天然黄酮（α,β-二羟基胡萝卜素和8-丙基柚皮素），提取黄腐醇含量 多的溶剂是甲醇＋二氯甲烷；丙酮、乙酸乙酯、甲醇的粗提物对镰刀菌的抑制所差无几，而亚甲基氯化物则对灰霉病菌有较强的抑制作用。EL-Hefny等使用乙酸乙酯和甲醇分别对大黄的根部进行萃取，分馏分离后物质用蒸馏水配制成含有黄酮-3-醇和二苯乙烯的药液，并对田间感染稻瘟菌的小麦进行抑菌试验；结果显示，其能显著抑制病菌孢子的萌发。

3.萜类化合物
 
    萜类化合物常用的提取方式为压榨法、水蒸气蒸馏法、脂浸润法、超灵界流体萃取法和溶剂提取法。前4种方法可用于提取精油，一般萜类提取都是根据提取物质的苷元形式选择不同极性、不同沸点的溶剂。Oludemi等将灵芝 行乙醇回流提取，干燥后按照提取时间78.9 min、提取温度90℃、溶剂62.5%乙醇进行热萃取，得到提取率为（4.9±0.6）%，含量为（435.6±21.1）mg/g的三萜。Popov等研究发现，乙酸乙酯提取白桦醇的纯度比95%乙醇提取的白桦醇纯度高，并且可以在乙酸乙酯提取完白桦醇之后，使用水蒸馏法将提取残渣中的乙酸乙酯回收，形成绿色萃取。Qun等通过使用蒸馏水，保证1∶55 （g/mL）的固液比，在超声波-微波辐照功率90Ｗ，提取周期75 s的条件下对角果进行三萜类化合物提取，得到16.789 mg/g，与预期相符。

4.挥发油
 
    挥发油 常见的成分就是单帖及倍半萜，因此提取精油时常用水蒸气法和超临界流体萃取法。Bammou等通过水精蒸馏装置对蚤草属进行水蒸气蒸馏，提取精油对尖孢镰刀菌有一定的抗性。Shukla等使用超临界CO₂对干姜进行多分离器在线分馏，CO₂回收率为96.15%。工业生产中的工艺优化及其验证标度单位表明，超临界CO₂萃取和同步萃取分馏可用于一系列天然生物活性化合物，如维生素、必需脂肪酸。Agha等采用二维气相色谱法和简易气相色谱法对天竺葵提取挥发油的化学成分进行检测，挥发油的主要成分是香茅醇、香叶醇和芳樟醇。挥发油也多用于果蔬保鲜及美妆行业中，所以使用超临界CO₂作为萃取剂，既价格低廉，又无残留，且不破坏化合物结构。在提取各类化合物时，除了根据不同提取物质选择不同极性的溶剂外，可以采用微波辅助提取或超声波辅助提取方式。对比传统的溶剂提取法，通过超声或微波产生切向力，使溶剂渗入，加速有效成分进入提取溶剂中，从而提高提取率，且不降低提取物的活性。郭孝武分别使用超声波辅助提取法、回流提取法、浸提法对益母草的总生物碱进行提取，发现超声波辅助提取法的提取率较其他2种方法要高，且未改变提取物的化学结构。
 
三、活性物质抑菌机制

1.生物碱类化合物
 
    生物碱类化合物可以在需要保护的细胞上形成一层保护膜，从而减少其他病菌对细胞的破坏。Zhao等使用异喹啉生物碱对稻瘟病菌进行抑制试验，结果表明，菌丝体弯曲、崩解，细胞膜完整性受损，同时还抑制菌丝的活性氧生成，破坏了菌丝的膜功能和细胞增殖。
对于病菌抑制，生物碱类化合物可对病菌细胞基因及酶类进行影响，或者对细胞膜、菌丝生长形态造成影响，从而达到抗病的作用。

2.黄酮类化合物
 
    黄酮类化合物的抗病性可能是非特异性的，通过黄酮类化合物的抗氧化性，使致病菌因缺氧而失去活性，影响生物膜的形成、膜的通透性等生理特性，影响某些酶对细胞质的抑制。Rachmawaty等对干燥的可可果进行粉碎后使用7∶3的丙酮水溶液浸提3次，得到黄酮类化合物，发现其对尖孢菌的孢子有强烈的抑制作用。Chen等研究发现黄芩素在32和64μg/mL时对病菌具有下调群体感应系统调节因子及基因细胞间粘附素在生物膜中的表达生产细胞的能力。
 
3.萜类化合物
 
    萜类化合物对真菌的抑制作用主要表现在对真菌菌丝的生长抑制，使其尖端膨胀、分支形成孢子梗或使菌丝断裂，对细胞造成破坏以及对真菌细胞蛋白的下调。杨婷等对13种萜类化合物进行抑菌筛选，其中，香芹酚、丁香酚、异丁香酚、枯茗醛、百里香酚对孢炭疽菌的 佳抑制浓度为50μg/mL。Alexa等对丹参和百里香分别进行萃取，得到γ-松油烯和ｐ-百里香酚，两者混合对禾谷镰刀菌有一定的抑制协同作用。丁兰等从香茶菜属中分离出4种萜类物质（leukamein E、weisiensin B、熊果酸和2-α-羟基熊果酸），并考察几种物质对蝴蝶兰茎腐病中分离出的镰孢属真菌的抑制活性；发现真菌的菌丝简短膨大成为囊泡，出现断裂，逐渐变为空泡；菌丝体细胞膜结构被严重破坏，且大大改变了其通透性。


4.挥发油
 
    挥发油是通过精油及其组分对细胞膜造成破坏，增大膜的通透性，致使细胞内的物质泄漏，或直接破坏病菌的酶系统，致其死亡。Moghaddam等发现从山羊草种子中提取的精油对青枯病菌有较强的抑制活性，能够显著抑制菌丝的生长。Yu等考察从茶树中提取的精油对灰霉病菌的抑制活性，研究发现精油中的α-松油醇、1,8-桉叶素混合后能穿透病菌细胞，破坏细胞器而不影响细胞膜透性。相比之下，松油烯破坏了膜的完整性，增加了膜的通透性，导致离子渗漏和膜功能障碍。
 
四、展望
 
    目前研究人员对各类植物源化合物已有一定的研究，但不同类型化合物的生物功能和生态化学功能尚未被充分研究，例如化合物在植物体内代谢过程、所具有的功能，以及在生态环境中的存在形式与归宿途径等。
 
    在提取工艺中，不仅要考虑优化工艺增加物质提取率或提取出其他物质类型，还要考虑提取成本，以及商业生产的经济性，是否适用于工厂批量化生产。例如将许多高质量的有价值的化合物被一个单一的步骤回收，从某种低廉的植物中得到大量高质量的化合物等。对于植物源农药，所需化合物的活性筛选仍然是新农药开发的关键步骤，具有较高活性的化合物可以直接开发为新药。化合物的结构对于抑菌活性有着重要影响，因此可以将“组学”技术与分子网络药理学相结合，在原物质结构的基础上进行结构修饰，合成具有高效抑菌能力的新物质。
 
来源：《黑龙江农业科学》2021年第7期
作者：淮阴工学院生命科学与食品工程学院  于忻滢  张国良  范松  黄志炜  张叶